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口蹄疫滅活疫苗：背景、生產及其使用

 

張龍 李培林 任偉 謝文強 郭建軍 宋振文 賈英 謝雪岑 李春燕 劉艷霞
（金宇保靈生物藥品有限公司,內蒙　呼和浩特　010030）
 
摘要：從疫苗上游的細胞培養(yǎng)到下游滅活乳化,分析了口蹄疫疫苗制造工藝的發(fā)展和變化,介紹了口蹄疫滅活疫苗歷史發(fā)展背景及其在口蹄疫防控中發(fā)揮的作用及今后的發(fā)展方向。
關鍵詞：口蹄疫；滅活疫苗；背景
 
1.   概述
口蹄疫（Foot and mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus, FMDV）引起的牛羊豬等家畜嚴重的急性傳染病，由于其傳播快，給畜牧業(yè)造成了巨大的經濟損失，而且嚴重影響國際貿易，世界動物衛(wèi)生組織將其列為必須上報的疫病之一。FMD血清型眾多，包括O、A、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型 共7個血清型，血清型間無交叉保護，造成疫病控制難度較大。截至到2010年12月，全球FMD流行國家達60個，大多集中在亞非拉等發(fā)展中國家，給這些國家的畜牧業(yè)發(fā)展帶來消極的影響，而因FMD貿易壁壘造成的畜產品出口損失遠遠大于疫病本身所帶來的動物死亡的損失。世界各國都通過種種努力實現(xiàn)OIE認定的“無FMD疫區(qū)國”地位，發(fā)達國家通過撲殺等措施幾乎沒有FMD的流行，而南美洲一些國家通過免疫接種等措施實現(xiàn)了無FMD疫區(qū)或部分地區(qū)無疫區(qū)。歐洲上世紀90年代開始實行不免疫策略,在疫情暴發(fā)時采用撲殺的手段控制FMD,但英國2001年FMD的爆發(fā)給當?shù)亟洕鐣斐删薮蟮膿p失，促使相關機構開始修訂FMD防控策略，2003年歐盟修訂了FMD防控策略，肯定了疫苗免疫在FMD爆發(fā)時的作用，隨后歐盟多個國家將疫苗免疫作為補充手段用于FMD的控制。滅活疫苗在歐美等地的FMD防制和根除中發(fā)揮了重要的作用，直到今天，滅活疫苗仍然是成功防控FMD的重要措施，經過幾十年的發(fā)展，F(xiàn)MD滅活疫苗在抗原生產、滅活、濃縮純化、乳化等方面不斷豐富和發(fā)展，在動物疫苗生產中已形成具有示范性的工業(yè)化生產體系。
目前，世界上FMD滅活疫苗生產和應用的主要有BEI滅活油佐劑疫苗和甲醛滅活鋁膠皂素疫苗，對于滅活疫苗的質量控制上，更注重于疫苗的生物安全和免疫效力兩個方面，因此，近些年來，F(xiàn)MD研究機構和生產廠家將力量集中到抗原生產工藝、滅活劑選擇、濃縮純化、佐劑以及生產過程疫苗效力的替代檢驗等關鍵技術的研究。
2.   FMD滅活疫苗歷史
縱觀FMD疫苗的研究和應用歷史，F(xiàn)MD疫苗經歷了滅活疫苗、活疫苗、滅活疫苗、新型疫苗這一歷史進程和發(fā)展趨勢。而滅活疫苗從最初的舌皮組織毒經甲醛滅活制成的疫苗到后來的細胞培養(yǎng)病毒經BEI滅活制成疫苗，經歷了20年的時間。FMD病毒抗原生產方式也主要有三種方式: 牛舌皮組織生產的Frenkel培養(yǎng)方法；轉瓶BHK21細胞單層培養(yǎng)法；BHK21細胞懸浮培養(yǎng)方法，轉瓶單層培養(yǎng)方法是勞動密集型生產方式，生產過程生物安全較難控制，容易散毒,而懸浮培養(yǎng)法屬于技術密集型生產方式，制備病毒抗原快速便捷，能很好的保持生產過程生物安全，是目前疫苗的主要生產方式。截止2011年年初,我國已有兩個國家指定口蹄疫疫苗企業(yè)采用了懸浮工藝生產口蹄疫疫苗。該工藝的推行勢必會給口蹄疫疫苗的生產甚至動物疫苗的生產的工藝帶來巨大革新，也勢必會促進我國獸用疫苗質量的巨大提升。有報道稱目前我國的口蹄疫疫苗質量及檢驗技術已達到世界水準。
2.1組織舌皮毒
該方法制造的FMD滅活疫苗最早可追溯到上世紀20年代。1926年，法國科學家Vallee等發(fā)現(xiàn)FMD病毒經甲醛滅活后，仍具有免疫原性，但工藝不好控制，滅活的病毒要么留有殘毒，要么失去了免疫原性。1939年，丹麥科學家Schmidt發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁膠體具有無毒性和免疫刺激的功能。1937年，德國科學家Waldmann首次將病毒的滅活與乳化引入到FMD疫苗生產中來，獲得了符合實際應用的FMD疫苗-鋁膠甲醛滅活疫苗。
1947年，F(xiàn)renkel等首次采用牛舌上皮細胞培養(yǎng)FMDV獲得成功，為抗原的大量生產提供了經濟、穩(wěn)定的途徑，該疫苗在歐洲FMD防控中發(fā)揮了巨大的作用。但這種疫苗制苗材料來源不易,生產和應用受到限制。
2.2 單層細胞培養(yǎng)毒
Frenkel等培養(yǎng)系統(tǒng)建立以后，組織培養(yǎng)學快速發(fā)展，原代細胞培養(yǎng)體系也迅速建立起來，1960年，利用轉瓶培養(yǎng)體系建立的牛腎細胞原代培養(yǎng)建立起來，緊接著，BHK21傳代細胞系得到了應用，傳代細胞比原代細胞具有較多的優(yōu)點。上個世紀60年代，人們就開始采用轉瓶生產病毒，該工藝成熟度高，占地面積小，投資成本小等優(yōu)點，因此許多國家建立了規(guī)�；a工廠，截至到目前，我國仍然以該工藝為FMD疫苗主要生產方式。然而，該系統(tǒng)勞動量大，生產過程難以保證生物安全和疫苗質量批次不穩(wěn)定等因素，幾乎在發(fā)達國家停止應用。1967年，人們利用微載體系統(tǒng)建立起了BHK21細胞懸浮培養(yǎng)體系，在實驗室的體系得到了批量化的生產。盡管如此，微載體由于其成本和系統(tǒng)的復雜性在FMD疫苗的應用上沒有得到工業(yè)化應用。
2.3懸浮細胞培養(yǎng)毒
1962年，人們發(fā)現(xiàn)BHK21細胞能全懸浮培養(yǎng)，細胞在此體系中增值速度很快，在較短的時間便可以達到工業(yè)化量。1985年，這種體系被廣泛的用在FMD疫苗生產中。至今，世界上已經有5000L的發(fā)酵罐在應用。細胞在一定濃度的小牛血清和MEM培養(yǎng)基中，密度在2～3d即可增加到5×106個/ml或更高。懸浮培養(yǎng)在FMD疫苗生產中處于核心地位。1965年，生物反應器懸浮培養(yǎng)最早用于口蹄疫疫苗生產，當時的生物反應器容積是30L。1983年，英國Wellcome公司就已能夠利用5000L的細胞罐大規(guī)模生產口蹄疫疫苗。目前，商品化的生物反應器已經可以達到20000L，大大提高了疫苗的生產效率和疫苗的質量，降低生產成本。
懸浮系統(tǒng)的應用，使無血清懸浮培養(yǎng)成為疫苗生產過程的主要工藝之一。通過用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清進行細胞懸浮培養(yǎng)，能減少后期純化工作，提高產品質量，在實際生產不僅能夠減少生產中污染幾率，而且還能避免血清中潛在的一些病原微生物影響細胞培養(yǎng)或者對疫苗使用者造成威脅，也便于在生物反應器中進行代謝流分析，實施在線過程監(jiān)控，精確投料。無血清產品更加符合國際GMP要求，對我國FMD疫苗走向國際市場具有重要的現(xiàn)實和長遠意義。
3.   FMD疫苗生產和使用中的關鍵要素
3.1病毒種子
一般來說，一個好的疫苗毒株應該選擇流行株，但是流行株不一定能夠作為疫苗毒株來使用，首先疫苗毒株必須適應細胞，保持其毒力、抗原性穩(wěn)定，而且其抗原譜必須廣，能夠保護大多數(shù)流行野毒的攻擊。因此，必須滿足上述條件的流行毒株才可以作為疫苗候選毒株。隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，基因序列分析在病毒流行病學研究上的具有重要的作用，序列測定在評價疫苗株與流行毒株親緣關系方面具有重要的參考價值，然而這種方法對篩選疫苗候選毒株作用不大，在疫苗毒株的篩選中，應更多的采用血清中和試驗和阻斷ELISA方法，r值是評價疫苗株與流行毒株抗原關系的主要指標。由于FMD容易發(fā)生變異，相關機構應定期分析本國或本地區(qū)疫苗株與流行毒株的抗原關系，以期選擇適合的疫苗去防控FMD。
選定的毒株必須在單層細胞或懸浮細胞上連續(xù)傳代，以期達到穩(wěn)定的生長狀態(tài)，病毒在不同種類和生長狀態(tài)的細胞適應力是不同的，一般來說，病毒在單層細胞上生長的狀態(tài)要明顯的好于懸浮細胞，這種結果可能與細胞的生長狀態(tài)有直接的關系，這就要求病毒在制作種子批的時候，應事先在單層上傳代，待病毒表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)時再用傳代細胞生長。然而，在疫苗制造過程中，因傳代會導致毒株的變異，因此，應盡量減少病毒的傳代次數(shù)，在研究和工業(yè)化生產中，應建立規(guī)范的種子批制度，我國病毒的種子批分為原始種子批、基礎種子批和生產用種子批，基礎種子批毒種必須經過嚴格的檢驗，由基礎種子批到疫苗成品的毒種代次應不超過5代。
3.2細胞及用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基
適應于FMDV生長的細胞除常用的BHK21細胞，還有IBRS細胞。一般來說，盡管BHK細胞來源于同一種組織，但是根據(jù)其傳代歷史，不同的細胞株對病毒的適應能力是不同的，有的細胞對病毒敏感，有的細胞不敏感。根據(jù)世界疫苗制造工藝的發(fā)展趨勢，能較好適應懸浮培養(yǎng)，短時間內大量增殖和支持病毒良好生長的懸浮細胞系是FMD工業(yè)化生產所必需的。在細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)基的選擇優(yōu)化尤其是血清的類別對細胞的生長和對病毒的敏感性尤為重要，需要具體技術人員不斷摸索、不斷選擇和優(yōu)化。
4.   疫苗生產關鍵過程控制
4.1細胞及病毒培養(yǎng)
能夠很好的支持病毒生產和穩(wěn)定傳代的細胞是疫苗生產的關鍵步驟之一，在現(xiàn)代FMD疫苗生產過程中，一般采用BHK21細胞懸浮培養(yǎng)工藝生產FMD疫苗。通常MOI為0.01即可在20h內使90%的細胞發(fā)生細胞病變。（MOI：感染比即1個感染單位/100個細胞使用）
4.2滅活及滅活檢驗
病毒滅活及滅活檢驗在FMD疫苗生產中是最關鍵的步驟之一，歷史上一些疫病的暴發(fā)與FMDV滅活不徹底有直接的關系。最早，人們采用甲醛滅活FMDV，甲醛通過病毒蛋白交聯(lián)而滅活病毒，對病毒核酸沒有改變，其滅活動力曲線難以確定，難以確定病毒何時滅活完全。隨后，氮丙啶類如AEI被用于病毒滅活，該類滅活劑作用于病毒核酸，抗原蛋白不受破壞，能很好的保持病毒的免疫原性，但毒性較大。目前，BEI是FMD疫苗生產的主要滅活劑，這種化學試劑滅活病毒能繪制出清晰的病毒滅活曲線，符合一級滅活動力曲線，對病毒安全，能保證病毒的抗原性，而且滅活徹底。對于不穩(wěn)定的疫苗株而言，采用甲醛和BEI共同滅活工藝能夠顯著降低滅活的時間，可由原來的40h降低到8h左右，而且更加安全。2008年出版的《OIE陸生動物衛(wèi)生法典》中建議，F(xiàn)MDV滅活采用0.3mM BEI濃度2次滅活，一般來說，為了徹底的滅活病毒，不使病毒逃逸，在工業(yè)生產中，一般要將一個滅活罐倒到另一個滅活罐。
滅活抗原的安全性通過敏感單層細胞或乳鼠傳代試驗證實。將滅活的抗原液接種到單層細胞，連續(xù)傳代2-3代，無CPE；樣品接種乳鼠后，連續(xù)觀察7日，應全部健活。10000L病毒懸液中的活病毒粒子應少于1個。
4.3抗原濃縮和純化
滅活疫苗刺激有效的免疫應答需要大量的抗原量，而且病毒增殖過程中的副產品如血清蛋白和病毒的非結構蛋白都會造成免疫動物的過敏反應。因此，通過離心或沉淀等方法去除細胞碎片或者在接種病毒前將含血清培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒。
4.4乳化
乳化是為了提高疫苗的免疫原性，將滅活好的抗原與佐劑以一定比例混合。一般常用的免疫佐劑有氫氧化鋁膠、皂甙和油佐劑。最早采用的佐劑是氫氧化鋁膠佐劑，在抗原中加入氫氧化鋁佐劑，氫氧化鋁佐劑和皂甙用于FMD疫苗，該類疫苗能顯著的保護牛免受FMDV的攻擊，但對豬的免疫保護力相對較低，這種疫苗在中東和亞洲部分地區(qū)仍在使用。1945年，油佐劑開始應用于FMD疫苗，油佐劑疫苗對牛和豬均能產生良好的保護力，疫苗的免疫持續(xù)期長，并且在其中加入Tween-80，降低疫苗的黏度，黏度小、穩(wěn)定性好和乳化簡便的油佐劑一直在不斷的發(fā)展和改進，如ISA206以及近些年來發(fā)展起來的“即用型”（Ready-to-use）油佐劑，將逐漸取代鋁膠和皂甙等傳統(tǒng)佐劑。
5.   疫苗質量控制
疫苗的質量控制是保證疫苗安全、有效的重要手段，在現(xiàn)代GMP條件具有重要的意義。好的疫苗不僅需要良好的毒株，符合質量標準的原材料，控制抗原生產過程的抗原含量和病毒滴度，還要做好病毒的滅活工作和乳化工作，成品檢驗中把好檢驗，無菌檢驗、安全性檢驗和效力檢驗等環(huán)節(jié)。
滅活疫苗誘發(fā)免疫應答通常需要大量的抗原含量，而且疫苗中的非病毒蛋白常常引起過敏反應，尤其在制造多價疫苗的時候，必須要對病毒抗原進行純化濃縮，以達到增加抗原含量和減少疫苗變態(tài)反應的目的。目前常用的濃縮方法有：1氯仿處理，2氫氧化鋁膠處理3超濾，4PEG處理。
抗原定量檢測技術補體結合（CF）試驗、定量蔗糖梯度密度分析法等可以直接測量計算出抗原中完整口蹄疫病毒粒子146S的值（ng/ml）,從而定量配制疫苗。
FMD疫苗的效力試驗，是通過PD50來表示，常規(guī)疫苗需至少達到3PD50，緊急接種疫苗需至少達到6PD50。目前，發(fā)到國家已經采用本動物替代方法檢測FMD疫苗的效力，該檢測方法也是我國FMD疫苗生產急需解決的關鍵技術之一。
生產環(huán)境，生產較高質量的疫苗必須有完全符合國家GMP要求的車間、硬件、設備、設施、檢驗室、符合要求的動物基地等。
質量保證機構：QA和QC及合格的供應穩(wěn)定的供應商。
6.   疫苗在FMD防控中的作用
滅活疫苗由于其可靠的安全性和良好的免疫效利，在FMD控制和消滅方面取得了成功并受到人們的廣泛承認，由最初的感染動物組織病毒制成的甲醛滅活疫苗到目前的懸浮培養(yǎng)生產病毒制成的油佐劑疫苗，使FMD疫苗制造成本更加廉價穩(wěn)定，到目前為止，F(xiàn)MD滅活疫苗無論從佐劑、滅活劑還是病毒抗原制備等方面均取得了很大的成就。但也有不足之處：對于有效的免疫，疫苗的抗原含量要保證，生物安全防護級別較高，滅活不完全可能導致散毒，另外，滅活疫苗的成本較高。
鑒于上述原因，在研制高質量FMD疫苗時，除了選擇免疫原性好，廣普性強以及適應病毒生長的基質外，還需要對病毒的免疫機理等作深入的研究分析，從疫苗制造的多個環(huán)節(jié)提高疫苗的安全性和免疫效力。隨著生物技術的發(fā)展，基因工程疫苗是未來疫苗的發(fā)展方向，并已經取得了一定的成果，然而，新型疫苗進入實際應用，不僅需要對FMDV免疫機制和分子特性做深入的研究，還需一系列復雜的風險評估等程序才能投入市場。時至今日，滅活疫苗仍然是FMD防控的主要物資，在疫病暴發(fā)時的緊急免疫具有無可比擬的優(yōu)勢，因此，進一步從滅活疫苗生產工藝等方面改善疫苗的免疫效力和良好的生物安全防控仍具有重要的現(xiàn)實意義，另外，F(xiàn)MD多價疫苗的使用也是FMD控制的主要趨勢。
參考文獻：
1、   陸生動物診斷試驗和疫苗手冊 第五版，2004 世界衛(wèi)生組織著 農業(yè)部獸醫(yī)局/中國動物衛(wèi)生與流行病學中心 譯；
2、   現(xiàn)代口蹄疫滅活疫苗—歷史背景及生產和使用中的關鍵要素 盧永干譯 朱彩株校；
3、 口蹄疫現(xiàn)狀與未來 弗朗西斯科．索布林那【西班牙】、埃斯特班．多明戈【西班牙】主編 朱彩株 張強 盧永干譯；
4、 獸用疫苗學 寧宜寶 主編 中國農業(yè)出版社；

口蹄疫 謝慶閣 主編 中國農業(yè)出版社；